Monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is een veeleisend en duur proces, waarbij verschillende zuiverings- en screeningsstappen nodig zijn om een bruikbaar preparaat te bekomen. Negative stain electron microscopy (EM) is een van de algemeen aanvaarde monstervoorbereidingstechnieken voor de eerste screening van gezuiverde monsters, en dan specifiek voor de beoordeling van pathologie, morfologie, concentratie en agglomeratie. Traditioneel wordt hiervoor een conventionele transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) gebruikt. Met de introductie van de desktop scanning transmissie elektronenmicroscoop (STEM) is een alternatieve oplossing voor het screenen van monsters ontwikkeld die een stuk sneller en kosten-effectiever is dan de traditionele methoden.
Desktop STEM als screening tool voor Cryo-EM
Desktop STEM als screening tool voor Cryo-EM
Monstervoorbereiding voor Cryo-EM
Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is uitgegroeid tot een hulpmiddel van onschatbare waarde op het gebied van structurele biologie, waarmee onderzoekers vanuit 2D-beelden bij verschillende oriëntaties driedimensionale structuren kunnen visualiseren met behulp van geavanceerde computationele technieken met een bijna-atomaire resolutie.
Cryo-EM is een arbeidsintensieve en tijdrovende techniek die zeer gespecialiseerde vaardigheden vereist. Een cruciaal hulpmiddel bij de monstervoorbereiding voor (3D) TEM is het ultramicrotoom.
Een typische exponent van deze technologie, de RMC Boeckeler ATUMtome (Automated Tape Collecting Ultramicrotome) is in staat om volautomatisch honderden tot duizenden coupes van enkele tientallen nanometers dikte te produceren. Hiermee wordt ingespeeld op de duidelijke evolutie van 2D naar 3D (cryo) – EM. Een interessante applicatienota in verband hiermee is de beeldvorming van mitochondriale uitstulpingen in zenuwcellen.
Goede Cryo-EM resultaten hangen ook af van de zeer hoge kwaliteit van de gezuiverde monsters. Voordat een monster wordt geverifieerd voor beeldvorming met hoge resolutie, wordt het meestal gescreend om er zeker van te zijn dat het geschikt is voor beeldvorming en de verwachte afmetingen en morfologieën bevat.
Meer informatie over Microtomen en Ultramicrotomen?
Als je vragen hebt of meer wilt weten, neem dan contact met ons op en we helpen je graag verder.
Negatieve stain EM
Bij deze techniek worden objecten “gekleurd” en omhuld met zware metaalzouten om ze vervolgens te observeren in een TEM. Er ontstaat een groot contrastverschil tussen de achtergrond en het te visualiseren object, waardoor een ‘negatief’ beeld van de deeltjes kan worden gevisualiseerd met een resolutie op nanometerschaal. De eenvoud van de bereiding van de grids en het hoge contrast bieden een ideale methode voor het beoordelen van onder andere pathologie, deeltjesgrootte, morfologie, concentratie en agglomeratie.
Over het algemeen wordt een conventionele TEM gebruikt om deze monsters te visualiseren. Dit leidt ertoe dat dure apparatuur wordt gebruikt om monsters te screenen in plaats van de beoogde toepassing voor beeldvorming met hoge resolutie. De cost of ownership kan aanzienlijk zijn, hetgeen financiële druk en tijdsdruk zet op onderzoekers die afhankelijk zijn van de apparatuur voor het screenen van monsters. Ook is de leercurve voor het gebruik van een TEM behoorlijk steil: nieuwe gebruikers hebben dagen tot weken nodig om zich te bekwamen in het zelfstandig bedienen van een TEM. Daarom is het onderzoek naar alternatieven voor speciale TEM-instrumenten een aantrekkelijke keuze voor diegenen die de voordelen van negatieve EM-kleuring voor het screenen van monsters willen maximaliseren.
Desktop STEM
Bij STEM-in-SEM wordt een SEM gebruikt om transmissiebeelden te maken. Sinds kort is STEM-in-SEM mogelijk met de Thermo Scientific Phenom Pharos desktop SEM met STEM detector. Deze krachtige combinatie van een desktop FEG-SEM en plug-and-play detector is compatibel met standaard EM-grids en kan bright field (BF), annular dark field (ADF) en high angle annular dark field (HAADF) beelden opnemen.
Dankzij de Phenom Pharos resolutie, die beter is dan 1 nanometer, duurt het maken van STEM beelden (analoog aan de fasecontrast TEM beelden uit traditionele negatieve kleur EM workflows) iets minder dan twee minuten zodra het monster is geladen. De compacte afmetingen, intuïtieve software en hardware bieden gebruikers aanzienlijke besparingen op het gebied van faciliteiten, onderhoud en trainingskosten. Bovendien kan de Pharos SEM geprogrammeerd worden om automatisch gegevens te verzamelen, zodat het volledige grid snel geïnspecteerd kan worden. Hierdoor kunnen operatoren op korte tijd een groot aantal beelden verzamelen voor de screening.
Meer informatie over Desktop SEM oplossingen?
Als je vragen hebt of meer wilt weten, neem dan contact met ons op en we helpen je graag verder.
Gebruik van de Pharos Dekstop STEM voor Negative Stain Imaging
Enkele voorbeelden van biologische monsters die in beeld zijn gebracht met de Phenom Pharos Desktop STEM:
Hierboven enkele voorbeelden van hoe een snelle pre-screening met SEM kan gebruikt worden om defecten die tijdens de monstervoorbereiding zijn opgetreden vast te stellen.
Hierboven enkele desktop STEM afbeeldingen van een nier . Deze kunnen voor pre-screening en/of voor pathologische anatomische diagnose.
Virusachtige deeltjes gekleurd met nano-tungsten die staafvormige en ronde morfologieën vertonen. Op basis van deze beelden kan een microscopist de grootte van de deeltjes meten en de zuiverheid, agglomeratie en algemene distributie van het monster beoordelen om te bepalen of verdere optimalisatie van het monster nodig is voor de vitrificatiestap in cryo-EM.
Samenvatting
Voor EM gebruikers die op een kosteneffectieve manier snel EM werk willen uitvoeren voor pre-screening of diagnostische doeleinden, biedt de Phenom Pharos Desktop STEM ongetwijfeld een oplossing. De Pharos kan bijvoorbeeld worden gebruikt om een high-res TEM te ontlasten, en dat alles tegen een fractie van de kosten. Hierbij biedt de Pharos STEM een hogere resolutie en meer contrast bij lagere KeV waarden dan een andere SEM
Ten overstaan van de klassieke TEM zijn er de volgende voordelen:
- Mogelijkheid tot beeldvorming bij lagere KeV
- Kleinere investering en cost-of-ownership
- Minder opleiding en ervaring vereist
- Een groter materiaalbereik
- Een groter beeldbereik
Met zijn veelzijdigheid en betaalbaarheid is de Phenom Pharos Desktop STEM een waardevolle aanvulling voor elke onderzoeksfaciliteit die zijn (cryo)-EM workflow wil stroomlijnen.
Vraag een demo aan
Ontdek superieure beeldvorming met Phenom. Vraag nu een demo of meer informatie aan!
