La préparation des échantillons pour la microscopie électronique cryogénique (cryo-ME) est un processus exigeant et coûteux, nécessitant plusieurs étapes de purification et de screening pour obtenir un échantillon utilisable. La microscopie électronique (ME) à coloration négative est l’une des techniques de préparation d’échantillons les plus couramment acceptées pour le screening initial des échantillons purifiés, en particulier pour l’évaluation de la pathologie, de la morphologie, de la concentration et de l’agglomération. Traditionnellement, un microscope électronique à transmission (MET) conventionnel est utilisé à cet effet. Avec l’introduction du microscope électronique à balayage (MEB) de table par transmission (STEM), une solution alternative pour le screening des échantillons a été développée, qui est beaucoup plus rapide et plus rentable que les méthodes traditionnelles.
Le STEM de table comme outil de screening pour la cryo-ME
Le STEM de table comme outil de screening pour la cryo-ME
Préparation des échantillons pour la Cryo-ME
La microscopie électronique cryogénique (cryo-ME) est devenue un outil indispensable dans le domaine de la biologie structurale, permettant aux chercheurs de visualiser des structures tridimensionnelles à partir d’images 2D dans différentes orientations en utilisant des techniques de computation avancées avec une résolution quasi-atomique.
La cryo-ME est une technique à forte intensité de main-d’œuvre et de temps qui nécessite des compétences très spécifiques. L’ultramicrotome est un outil essentiel dans la préparation des échantillons pour la MET (3D).
Le RMC Boeckeler ATUMtome (Automated Tape Collecting Ultramicrotome) est un exemple typique de cette technologie. Il est capable de produire des centaines, voire des milliers de sections de plusieurs dizaines de nanomètres d’épaisseur de manière entièrement automatique. Cela correspond à l’évolution évidente de la 2D vers la 3D (cryo)-ME. Une application intéressante à cet égard est l’imagerie des protubérances mitochondriales dans les cellules nerveuses.
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De bons résultats en cryo-ME dépendent également de la très haute qualité des échantillons purifiés. Avant qu’un échantillon ne soit vérifié pour l’imagerie à haute résolution, il est généralement examiné pour s’assurer qu’il est adapté à l’imagerie et qu’il contient les dimensions et les morphologies attendues.
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Coloration négative ME
Dans cette technique, les objets sont « colorés » et recouverts de sels de métaux lourds, puis observés dans un MET. Une grande différence de contraste est créée entre l’arrière-plan et l’objet à visualiser, ce qui permet de visualiser une image « négative » des particules avec une résolution de l’ordre du nanomètre. La simplicité de préparation des grilles et le contraste élevé constituent une méthode idéale pour évaluer la pathologie, la taille des particules, la morphologie, la concentration et l’agglomération, entre autres.
En général, un MET conventionnel est utilisé pour visualiser ces échantillons. Cela conduit à l’utilisation d’équipements coûteux pour analyser les échantillons au lieu de l’application prévue de l’imagerie haute résolution. Le coût de propriété peut être important, ce qui met une pression financière et temporelle sur les chercheurs qui dépendent de l’équipement pour cribler les échantillons. En outre, la courbe d’apprentissage pour l’utilisation d’un MET est assez raide : les nouveaux utilisateurs ont besoin de quelques jours à quelques semaines pour devenir compétents dans l’utilisation d’un MET de manière indépendante. Par conséquent, l’exploration d’alternatives aux instruments TEM dédiés est un choix intéressant pour ceux qui souhaitent maximiser les avantages de la coloration négative ME pour le screening d’échantillons.
STEM de table
Le détecteur STEM, utilisé dans un MEB, permet de créer des images électroniques en transmission. Depuis récemment, le détecteur STEM est disponible sur la technologie “de table” grâce au MEB de table Thermo Scientific Phenom Pharos. Cette puissante combinaison entre FEG-MEB de table et un détecteur STEM “prêt à l’emploi » fonctionne avec des grilles MET standards et permet de capturer des images en champ clair (BF), en champ sombre annulaire (ADF) et en champ sombre annulaire à grand angle (HAADF).
Grâce à la résolution du Phenom Pharos, qui est inférieure à 1 nanomètre, la création d’images STEM (analogues aux images MET en contraste de phase des workflows ME traditionnels en coloration négative) prend un peu moins de deux minutes une fois l’échantillon chargé. Les dimensions compactes de l’équipement, son logiciel intuitif offrent aux utilisateurs une plus-value considérable en termes d’installations, de maintenance et de coûts de formation. De plus, le FEG de table Pharos peut être programmé pour collecter automatiquement des données, permettant ainsi une inspection rapide de l’ensemble de la grille. Cela permet aux opérateurs de collecter, en peu de temps, un grand nombre d’images pour le screening.
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Utilisation du STEM de table Pharos pour l'imagerie par coloration négative
Quelques exemples d’échantillons biologiques imagés avec le STEM de table Phenom Pharos:
Ci-dessus, quelques exemples d’un pré-screening MEB rapide pour détecter les défauts de préparation des échantillons.
Ci-dessus, quelques images STEM de table d’un rein. Celles-ci peuvent être utilisées pour le pré-screening et/ou pour le diagnostic anatomopathologique.
Des particules de type viral colorées au nano-tungstène présentant des morphologies en bâtonnets et rondes. Sur base de ces images, un microscopiste peut mesurer la taille des particules et évaluer la pureté, l’agglomération et la distribution générale de l’échantillon pour déterminer si une optimisation supplémentaire de l’échantillon est nécessaire pour l’étape de vitrification en cryo-ME.
Résumé
Pour les utilisateurs de ME qui souhaitent effectuer rapidement des travaux de manière rentable pour le pré-screening ou à des fins diagnostiques, le STEM de table Phenom Pharos offre sans aucun doute une solution. Par exemple, le Pharos peut être utilisé pour soulager un MET haute résolution, et tout cela à une fraction du coût. Le STEM Pharos offre une résolution plus élevée et plus de contraste à des valeurs de KeV plus faibles qu’un autre MEB.
Par rapport au TEM classique, il présente les avantages suivants :
- possibilité d’imagerie à des valeurs de KeV plus faibles
- investissement et coût de propriété plus faibles
- moins de formation et d’expérience requises
- une gamme de matériaux plus large
- une gamme d’images plus large
Avec sa polyvalence et son accessibilité, le STEM de bureau Phenom Pharos est un ajout précieux pour toute installation de recherche souhaitant rationaliser son flux de travail (cryo)-ME.
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