Desktop STEM für schnelles Probenscreening bei Kryo-EM

Die Probenvorbereitung für die Kryo-Elektronenmikroskopie ist ein anspruchsvoller und oft teurer Prozess. Er erfordert mehrere Reinigungs- und Screening-Schritte, um eine geeignete Probe herzustellen. Die „Negative Staining”-Elektronenmikroskopie (EM) ist eine der bekanntesten Probenvorbereitungstechniken für das erste Screening gereinigter Proben und insbesondere für die Bewertung von Pathologie, Morphologie, Konzentration und Agglomeration. Klassischerweise wird zu diesem Zweck ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) verwendet. Mit der Einführung eines TEM-Detektors in ein Desktop-Rasterelektronenmikroskop (SEM) steht nun eine alternative Methode für das Screening von Proben zur Verfügung, die wesentlich schneller und kostengünstiger ist als herkömmliche Methoden, das sogenannte S(T)EM oder STEM.

PROBENVORBEREITUNG FÜRKRYO-EM

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich zu einem unschätzbaren Werkzeug in der Strukturbiologie entwickelt, mit dem Forscher dreidimensionale Strukturen aus 2D-Bildern in verschiedenen Orientierungen mit nahezu atomarer Auflösung mit Hilfe von hochentwickelter Software visualisieren können.

Kryo-EM ist eine arbeits- und zeitaufwändige Technik, die hochspezialisierte Fähigkeiten der Anwender erfordert. Ein entscheidendes Werkzeug bei der Probenpräparation für (3D-) TEM ist das Ultramikrotom

Ein typischer Vertreter dieser Technologie ist das RMC Boeckeler ATUMtome (Automated Tape Collecting Ultramicrotome). Es ist in der Lage, vollautomatisch hunderte bis tausende von Schnitten mit einer Dicke von mehreren zehn Nanometern herzustellen und ermöglicht so die klare Entwicklung von 2D zu 3D (Kryo)-EM. Ein interessantes Anwendungsbeispiel in diesem Zusammenhang ist die Darstellung von mitochondrialen Ausstülpungen in neuronalen Zellen

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Gute Kryo-EM-Ergebnisse hängen auch von der sehr hohen Qualität der gereinigten Proben ab. Bevor eine Probe für die hochauflösende Bildgebung vitrifiziert wird, muss sie in der Regel kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass sie für die Bildgebung geeignet ist und die erwarteten Abmessungen und Morphologien aufweist.

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‘NEGATIVE STAIN’ ELEKTRONENMIKROSKOPIE

Bei dieser Methode wird die Probe auf dem TEM-Grid absorbiert und dann gefärbt. Im Elektronenmikroskop wird durch den Hintergrund im Verhältnis zu den Partikeln ein hoher Masse-Dicke-Kontrast erzeugt, so dass ein „Negativbild“ der Partikel mit einer Auflösung im Nanometerbereich sichtbar gemacht werden kann. Die einfache Präparation des Grids und der hohe Kontrast machen es zu einer idealen Methode, um unter anderem pathologische Details, Morphologie, Konzentration und Agglomeration zu beurteilen.

In der Regel wird ein herkömmliches TEM zur Abbildung dieser Proben benötigt. Dies führt dazu, dass teure Geräte für das Screening der Vorab-Proben verwendet werden, anstatt für die beabsichtigte Anwendung der hochauflösenden Bildgebung. Die Kosten für die Einrichtung und die häufigen Wartungsarbeiten können beträchtlich sein, was die Forscher, die zum Screening der Proben auf die Geräte angewiesen sind, finanziell und zeitlich unter Druck setzt. Auch die Lernkurve für die Verwendung eines TEM kann recht steil sein: Neue Benutzer benötigen Tage bis Wochen, um sich mit der selbständigen Bedienung eines TEM vertraut zu machen. Daher ist es für diejenigen, die die Vorteile der negativen EM-Färbung für das Probenscreening maximieren wollen, attraktiv, Alternativen zu speziellen TEM-Geräten in Erwägung zu ziehen.

Desktop STEM

Bei STEM-im-REM wird ein REM (Rasterelektronenmikroskop) verwendet, um Transmissionsbilder zu erzeugen. Seit kurzem ist STEM-in-REM für das Thermo Scientific Phenom Pharos Desktop-REM durch den STEM-Detektor verfügbar. Diese leistungsstarke Kombination aus einem Desktop-FEG (Feldemissions)-REM und einem Plug-and-Play-Detektor ist mit Standard-REM-Grids kompatibel und kann Hellfeld- (BF=’bright field’), Ring-Dunkelfeld- (ADF=’annular dark field’) und Hochwinkel-Ring-Dunkelfeld- (HAADF=’high angle annular dark field’) Bilder aufnehmen.

Dank der Auflösung des Phenom Pharos, die bei STEM unter 1 Nanometer liegt, dauert die Erstellung von STEM-Bildern (analog zu Phasenkontrast-TEM-Bildern aus herkömmlichen Negativ-Farb-EM-Arbeitsabläufen) nur knapp zwei Minuten, sobald die Probe geladen ist. Die kompakte Größe, die intuitive Software und die Hardware bieten den Anwendern erhebliches Einsparpotential in Bezug auf Einrichtung, Wartung und Schulungskosten. Darüber hinaus kann das Pharos REM auch vollautomatisch Bilder aufnehmen, was eine schnelle Überprüfung des gesamten Grids ermöglicht. Auf diese Weise können die Bediener in kurzer Zeit eine große Anzahl von Bildern für das Screening sammeln.

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VERWENDUNG DES PHENOM DESKTOP STEM FÜR ‘NEGATIVE STAIN’ EM

Einige Beispiele von negativ gefärbten biologischen Proben, die mit dem neuen Phenom Pharos Desktop STEM aufgenommen wurden:

Oberhalb sind einige Beispiele dafür zu sehen, wie ein schnelles Vorab-Screening mit REM dafür genutzt werden kann, Defekte zu finden, die während der Probenvorbereitung entstanden sind.

Beschädigte Fenster im Grid und gut gefärbte Bereiche.

Kontaminationen und agglomerierte Proben.

Oben sehen Sie einige Desktop-STEM-Bilder von Ultramikrotom-Dünnschnitten von Nieren. Diese können für Prescreening, Pathologie und anatomische Diagnostik genutzt werden.

Mit Nano-Wolfram gefärbte virusähnliche Partikel mit stäbchenförmiger und runder Morphologie. Anhand dieser Bilder kann ein Mikroskopiker die Partikelgröße messen und die Reinheit, Agglomeration und Gesamtverteilung der Probe beurteilen, um zu entscheiden, ob eine weitere Optimierung der Probe für die Vitrifizierung zur Kryo-EM erforderlich ist.

ZUSAMMENFASSUNG

Für EM-Anwender, die nach einer kostengünstigen Möglichkeit suchen, Voruntersuchungen oder diagnostische Untersuchungen schnell durchzuführen, ist das Phenom Pharos Desktop STEM zweifellos eine hervorragende Lösung. Das Gerät kann als Ersatz für ein hochauflösendes TEM verwendet werden -und das zu einem Bruchteil der Kosten. Dabei bietet das Pharos STEM eine höhere Auflösung und mehr Kontrast bei niedrigeren kV-Werten als jedes andere Desktop-REM.

Die großen Vorteile gegenüber des klassischen TEM sind:

Die Möglichkeit, bei niedrigerer Beschleunigungsspannung (‘low kV’) abzubilden
Geringere Investitions- und Betriebskosten
Weniger Ausbildungszeit und Erfahrung erforderlich
Breiterer Materialbereich
Größerer Abbildungsbereich

Dank seiner Vielseitigkeit und seines günstigen Preises ist das Phenom Pharos Desktop STEM eine wertvolle Ergänzung für jede Forschungseinrichtung, die ihren (Kryo)-EM-Workflow rationalisieren möchte.